Spektrofotometrie

Spektrofotometr VIS

  = přístroj pro měření množství prošlého záření viditelné oblasti elektromagnetického spektra.                             

Je tvořen čtyřmi základními částmi:

• Zdroj záření: Pro viditelnou oblast je používána wolframová žárovka
• Monochromátor: Zařízení propouštějící úzkou část spektra (1-2 nm), kterou oddělí ze spojitého spektra pomocí mřížky/ hranolu. Jeho natáčením se mění vlnová délka, která je posílána do prostoru, kde je umístěna kyveta se vzorkem.
• Absorpční prostředí: Monochromatické záření vstupuje do kyvetového prostoru, kde je měřený vzorek (jako tzv. slepý vzorek, na který přístroj kalibrujeme při změně vlnové délky, je obvykle v praktiku použita deionizovaná voda. Je třeba se podívat, kudy kyvetovým prostorem prochází světlo (liší se u různých přístrojů)
• Detekční systém: Fotonásobič = citlivý detektor schopný zachytit i velmi slabý signál. 

1)     Absorpční spektrum

Úkol:

Proměřte absorpční spektrum komplexu Fe²⁺-o-fenantrolin v oblasti vlnových délek 400-700 nm (v oblasti 440 - 560 nm po 10 nm, ve zbytku po 20 nm). Sestrojte graf.

Z grafu vyhodnoťte absorpční maximum Fe²⁺-o-fenantrolinu. Dále podle absorpčního maxima vyhodnoťte, jakou barvu roztok pohlcuje na základě komplementarity barev.

2)     Spektrofotometrické stanovení iontů dvojmocného železa – sestrojení kalibrační křivky

Úkol:

Sestrojte kalibrační křivku pro stanovení iontů dvojmocného železa s využitím tvorby barevného komplexu s o-fenantrolinem. S využitím kalibrační křivky vyhodnoťte koncentrace neznámých roztoků.

Pomůcky:

Kvalitní deionizovaná voda, střička, síran amonnoželeznatý hexahydrát (NH₄)₂Fe(SO₄)₂. 6H₂O, 8 ks odměrných baněk o objemu 50-250 ml, sada nedělených pipet (1-10ml), 10 zkumavek (malých silnostěnných), 0,2% roztok o-fenantrolinu (komplexní činidlo), automatická mikropipeta 250 μl.

Postup:

Veškeré nádobí, které budete v úloze používat (odměrné baňky, zkumavky, pipety) si před započetím práce vypláchněte kvalitní deionizovanou vodou a poté otřepte (každou nádobu alespoň třikrát menším množstvím deionizované vody).

Připravte 100 ml roztoku Mohrovy soli (hexahydrát síranu amonnoželeznatého, M = 392,14 g/mol) o přesně známé koncentraci v rozmezí 0,8 – 1,2 × 10^-3 mol/l (tedy navážka v rozmezí 0,0314 – 0,0471 g). Tento roztok je zásobním roztokem. K navážce přidejte cca 2–5 ml 5 % HCl, poté cca 10 ml deionizované vody, rozpusťte a po rozpuštění kvantitativně převeďte do odměrné baňky. Odměrnou baňku si označte „zásobní roztok“.

Ze zásobního roztoku připravte řadu pracovních roztoků tak, že zásobní roztok naředíte 250krát, 100krát, 50krát, 25krát, 20krát, 10krát a 5krát. Roztoky připravujte velmi pečlivě, každá chyba se projeví na kalibračním grafu. Jednotlivé odměrné baňky si označte pomocí objemů (1/250, 1/100, 2/100, …), stejným způsobem si označte i jednotlivé zkumavky.

Každý odměrný roztok ihned po doplnění odměrné baňky pečlivě promíchejte (po uzavření zátkou otočte několikrát dnem vzhůru a bublinu nechte projít až ke dnu – míchá bublina). Z každého pracovního roztoku odpipetujte 5ml (nedělenou pipetou) do zkumavky (celkem tedy budete mít 7 zkumavek). Pipetovat začněte od nejméně koncentrovaného roztoku, pipetu nepromývejte mezi vzorky vodou, při přechodu k roztoku k vyšší koncentraci natáhněte do pipety jeden objem nového roztoku a vypusťte do odpadní kádinky.

Po napipetování vzorků přidejte pomocí automatické pipety do každé zkumavky 250 μl o-fenantrolinu, který reaguje s dvojmocným železem na růžovočervený komplexní kation. Zkumavky ihned po přidání činidla zamíchejte pomocí vortexu (elektrická míchačka).

Ze vzorků o neznámé koncentraci odpipetujte z každého jedenkrát 5 ml do předem vymytých zkumavek a opět přidejte o-fenantrolin. Zkontrolujte, zda intenzita zbarvení není mimo rozsah kalibrační křivky. Pokud ano, nařeďte původní neznámý vzorek (1 ml vzorku + 10 ml H₂O, což znamená, že vzorek byl naředěn 11 krát), z tohoto neředěného roztoku odpipetujte 5 ml do další předem vymyté zkumavky a přidejte o-fenantrolin.

Změřte absorbanci jednotlivých vzorků kalibrační křivky při 510 nm – začněte měřit od nejméně koncentrovaných roztoků (nemusíte pak mezi jednotlivými měřeními vyplachovat kyvety, jen odsajete zbylou kapku buničitou vatou). Roztoky po změření vracejte z kyvety zpět do příslušné zkumavky.

Sestrojte kalibrační přímku stanovení iontů dvojmocného železa (tj. závislost absorbance na koncentraci iontů Fe²⁺).

Změřte absorbance neznámých vzorků, z kalibrační křivky odečtěte koncentrace neznámých vzorků. Pokud jste neznámý vzorek ředili, z kalibrační křivky dostanete koncentraci zředěného vzorku, pro získání koncentrace původního vzorku je potřeba tuto koncentraci vynásobit faktorem ředění.