Separační techniky

1.   Extrakce vytřepáváním

Extrakce z kapaliny do kapaliny je založena na přechodu rozpuštěné látky z jedné kapalné fáze do jiné, s původním rozpouštědlem nemísitelné kapaliny, v níž je látka lépe rozpustná než v původním rozpouštědle. Může být použita buď k získání požadované látky z roztoku, nebo k odstranění nežádoucí nečistoty z rozpouštědla.

Úkol:

• Proveďte extrakci methylenové modři (MM) z vodného roztoku vytřepáním do butanolu
• Proveďte pokus o extrakci modré skalice z vodného roztoku do butanolu

Postup:

• Zkontrolujte, zda je vypouštěcí ventil připravené dělící nálevky zavřený
• Do dělicí nálevky odměřte odměrným válečkem 35 ml roztoku MM
• Za pomoci vedoucího přidejte do dělící nálevky dávkovačem 10 ml butanolu
• Vytřepejte (nezapomeňte na uvolnění přetlaku po prvním krátkém protřepání)
• Třepejte 2-3 minuty, po té nálevku odložte do kruhu a počkejte, až budou obě fáze dobře oddělené (rozhraní úzké). Porovnejte zbarvení obou fází se stavem před začátkem vytřepávání
• Porovnejte vzhled obou extrakcí a rozdíly zapište do připravené tabulky
• Odpusťte vodnou fázi do připravené kádinky tak, aby se rozhraní zastavilo právě ve výpustním kohoutu
• Popište změnu vzhledu Na₂SO₄ a zdůvodněte tuto změnu
• Proveďte vytřepávání roztoku modré skalice stejně jako u roztoku MM, zdůvodněte rozdíl po provedeném vytřepávání
• Použité nádobí umyjte ve vodovodní vodě a nechte okapat

 2.   Dialýza

Dialýza je metoda založená na pronikání malých částic přes polopropustnou membránu z prostředí o vyšší koncentrací do prostředí o nižší koncentraci.

Úkol:

• Prověření funkce dialyzační membrány ve formě dialyzační trubice
• Dialýza směsi tvořené bílkovinou (vaječným bílkem – velká molekula s rel. mol. hmotností 67 000) a nízkomolekulární iontovou sloučeninou (modrou skalicí)
• Membrána propustí pouze malé kationty a anionty
• Prokázání přítomnosti iontů - vně membrány reakcí měďnatých iontů s amoniakem
• Prokázání přítomnosti  iontů reakcí s barnatými ionty
• Prokázání přítomnosti bílkoviny pouze uvnitř membrány povařením vzorku z vnitřku membrány a vzorku roztoku vně membrány
• Sestrojení grafu závislosti intenzity zbarvení (velikosti absorbance) na době dialýzy

Postup:

• Do kádinky o objemu 25 ml odměřte 10 – 15 ml zásobního nasyceného roztoku modré skalice a 5 ml roztoku bílkoviny (v obou případech použijte pouze stupnici na kádince)
• Do kádinky o objemu 400 ml nalijte cca 250 ml deionizované vody
• Vložte (po stěně) magnetické míchadlo
• Kádinku postavte na magnetickou míchačku a spusťte míchání o takové intenzitě, aby se dělal znatelný vír
• Připravte si stopky a odeberte si vzorek v čase 0 minut
• Nasaďte si rukavice!
• Navlečte si rukavice a namočenou dialyzační trubici vytáhněte opatrně z vody dvěma prsty
• Na jednom konci udělejte pevný uzel
• Stěny trubice oddělte od sebe a opatrně vlijte do trubice směs bílkoviny a modré skalice
• Vytlačte přebytečný vzduch nad roztokem v trubici, udělejte pevný uzel na horním konci kus nad hladinou (do trubice bude v průběhu pokusu přecházet voda, je nutné tam mít prostor, aby trubice nepraskla)
• Opláchněte trubici zvenku střičkou (do odpadu)
• Dialyzační membránu ponořte do připraveného dialyzačního roztoku (celá oblast trubice s roztokem musí být ponořena) a spusťte měření času
• Od okamžiku ponoření měřte čas (v minutách) a odebírejte vzorky do připravených popsaných zkumavek (vždy 5 ml dialyzačního roztoku z velké kádinky) v postupně se prodlužujících intervalech (doporučené časy pro odběr vzorků: 0 min (již odebrán před vložením trubice), 1 min, 3 min, 5 min, 7 min, 10 min, 13 min, 16 min, 20 min)
• Do zkumavek s odebranými vzorky přikápněte 8 kapek zředěného amoniaku
• Po přidání amoniaku obsah zkumavky opatrně leč důkladně promíchejte
• Proměřte absorbanci roztoků v jednotlivých zkumavkách při 600 nm (absorpční maximum tetraamminměďnatého komplexu) - vzorky po proměření absorbance vracejte vždy zpět do zkumavek
  • Začněte měřit od vzorku s nulovým časem, postupujte směrem k delším časům (a tím k vyšším koncentracím komplexu s amoniakem a tedy k intenzivnějšímu zbarvení), nemusíte pak vyplachovat kyvetu mezi jednotlivými vzorky
  • Naměřené absorbance zapisujete do připravené tabulky
• Vyneste do grafu závislost absorbance při 600 nm na době dialýzy
• Po proměření vyndejte dialyzační trubici z dialyzačního roztoku (manipulaci opět provádějte v rukavicích)
• Odstřihněte jeden uzel (přitom držte membránu opatrně za záhyb pod uzlem) a vylijte obsah trubice do kádinky vhodné velikosti (25 ml) a z ní následně cca 2 ml odlijte do zkumavky
• Do jiné zkumavky odeberte 2 ml dialyzačního roztoku
• Sundejte si rukavice!
• Obě zkumavky vložte do kádinky (250 ml) s cca 50 ml vodovodní vody a dejte na vařič ohřát k varu
• Srovnejte vzhled roztoků v obou zkumavkách po zahřátí
• Z kádinky s dialyzačním roztokem odlijte cca 2 ml do další zkumavky a prokažte přítomnost síranových anionů přídavkem několika kapek roztoku ₂
• Ze získaných údajů a pozorování vyvoďte závěr o propustnosti dané membrány pro bílkovinu a pro nízkomolekulární iontové sloučeniny, resp. jednotlivé ionty

 3.   Chromatografie

Chromatografie je fyzikálně-chemická metoda, která slouží k rozdělení vícesložkového vzorku ideálně na jednotlivé složky. Je založená na rovnovážné distribuci mezi mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou) fázi. Pomocí chromatografie lze například rozdělit listová barviva a prokázat, že i v zelených listech se vyskytují karotenová a xantofylová barviva. Zelené části rostlin obsahují vedle zelených barviv (chlorofylů) i karotenová a xantofylová barviva; tato barviva se manifestují při dozrávání plodů či při podzimním žloutnutí listí

Příklady rostlinných barviv: Chlorofyl a, Chlorofyl b, Β-karoten, Lutein

Úkol:

• Pomocí rozdělovací chromatografie se přesvědčte o přítomnosti karotenových a xantofylových barviv i v zelených rostlinách

Postup:

• Přibližně 2 g rostlinného materiálu nastříhejte do třecí misky
• Přidejte cca 10 ml acetonu, špetku CaCO₃ nebo MgCO₃ (k neutralizaci kyselin, které by po vyluhování barviv poškodily chlorofyly) a trochu jemného písku (kvůli lepšímu roztírání), rozrušte strukturu listu a  vzorek zfiltrujte do malé kádinky (25 ml)
• Na chromatografickém papíře vyznačte ve vzdálenosti cca 3 cm od spodního okraje papíru lehce tužkou podle pravítka startovací linii a označíte na ní 3 body nejméně 3 cm od sebe a 2 cm od okrajů papíru)
• Veškeré popisy (který bod přísluší kterému vzorku) musí být u horního okraje papíru a to pouze obyčejnou tužkou
• Na označené body tečkujte opakovaně v menších dávkách a po zaschnutí předchozího nanesení (nejméně 10x) vzorky extraktů pomocí špičky od mikropipety (na každý vzorek nová špička)
• Průměr skvrny nemá přesáhnout 5 mm, aby se jednotlivé skvrny během vyvíjení neslévaly
• Chromatografický papír vložte do chromatografické komory – mírně jej stočte, zasuňte rovně startem dolů do vyvíjecí směsi (start musí zůstat nad hladinou), přiklopte a ponechte vyvíjet, dokud čelo nedojde tak 1 cm pod horní okraj papíru (v chromatografické komoře bude vždy jen jeden chromatografický papír)
• Pak vyvíjení přerušte, papír vyndejte, vyznačte čelo chromatogramu a chromatogram vyfotografujte (barviva nejsou na světle stálá)
• Společně s vedoucím cvičení vyhodnoťte, jaká barviva se podařilo v jednotlivých vzorcích prokázat