Kapalinová chromatografie

Kapalinový chromatograf:

Pro stanovení a určení koncentrace kofeinu v nápojích je vhodná metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Obecně principem chromatografických metod je dělení analytů vzorku mezi mobilní (pohyblivou) fázi a stacionární (nepohyblivou) fázi. V případě kapalinové chromatografie je mobilní fáze tvořena rozpouštědly o různé polaritě (např. voda, metanol, acetonitril) a jako stacionární fáze je vhodný sorbent například modifikovaný silikagel s navázanými dlouhými uhlíkatými řetězci. Na Obr. 2. je schéma kapalinového chromatografu. Chromatograf se skládá z těchto částí: zásobníky mobilní fáze, čerpadlo mobilní fáze, dávkovací zařízení, kolona, detektor, PC a nádoba na odpad. 

Obr. Schéma kapalinového chromatografu.

Mobilní fáze je čerpána ze zásobníku pod vysokým tlakem. Do proudu mobilní fáze je nastříknut malý objem analyzovaného vzorku, který je poté společně s mobilní fází unášen na kolonu. Kolona je umístěna v termostatu. Složky vzorku (analyty) jsou unášeny tokem mobilní fáze a interagují se stacionární fází. Na koloně dochází k zadržování a postupnému rozdělování stanovovaných složek vzorku (analytů). Každý analyt interaguje se stacionární fází „jinak intenzivně“, proto se složky vzorku rozdělí. Doba, za kterou jsou eluovány („vymyty“) z kolony, se nazývá retenční čas. Na základě retenčních časů se následně určuje, o jakou látku se jedná. Níže je vidět, že červený analyt interaguje se stacionární fází méně „intenzivně“, vidíme ho v chromatogramu jako první, má tedy kratší retenční čas. 

Obr. Chromatografická separace vzorku se dvěma analyty.

UV-VIS detektor:

Za kolonou je umístěn detektor, který vysílá signál do počítače. Detektor je v tomto případě spektrofotometrický (UV/VIS). Časový záznam signálu detektoru se nazývá chromatogram. Ten je následně vyhodnocován na PC. Spektrofotometrický detektor pracuje na principu měření absorbance eluátu („vymyté látky“). Pokud se pracuje s detektorem s diodovým polem (tento případ) může se měřit v celém spektru vlnových délek (190 až 780 nm) v jeden okamžik. Spektrofotometrický detektor pracuje na principu Lambert-Beerova zákona, který vyjadřuje vztah mezi délkou optické dráhy l, koncentrací absorbující složky c a absorbancí A. Konstanta , tzv. molární absorpční koeficient, který je charakteristický pro určitou látku a vlnovou délku absorbovaného záření. Lambert-Beerův zákon je dán vztahem:

Obr. Schéma UV/VIS detektoru: (1) deuteriová výbojka, (2) výstupní štěrbina, (3) otočná difrakční mřížka, (4) výstupní štěrbina, (5) čočka, (6) clona, (7) průtoková cela detektoru, (8) fotodioda.

Aby molekula mohla absorbovat záření, musí ve své struktuře obsahovat tzv. chromofor. Takovouto strukturou je systém konjugovaných dvojných vazeb, násobné vazby mezi atomy nebo atomy s volným elektronovým párem, O, N a S.

Vyhodnocování výsledků:

Potřebná data pro kvalitativní i kvantitativní analýzu jsou získány využitím chromatografickým programů, v tomto případě v programu Chromeleon. Ke kvalitativnímu hodnocení látek jsou v HPLC používány retenční časy. K identifikaci píku (peaku) lze i částečně používat absorpčních spekter při použití detektoru s diodovým polem (DAD detektor), který je používán při této analýze. Určení koncentrace stanovované látky (analytu) ve vzorku je analýza kvantitativní. Informace o koncentraci dané látky poskytuje plocha píku, která se získá integrací (určením plochy pod křivkou v chromatogramu). Při kvantitativním hodnocení se hledá vztah mezi plochou píku analytu v chromatogramu a množstvím eluované látky. Nejjednodušším způsobem, jak kvantitativně hodnotit analyzované látky ve vzorku, je metoda kalibrační křivky. Nejprve je analyzována série kalibračních roztoků, roztoků stanovovaných látek – v tomto případě kofein pro vzorky nápojů. Kalibrační roztoky se připraví rozpuštěním standardů (čistých látek). Kalibrační roztoky mají různé, ale známé koncentrace. Obvykle je připravováno 5-7 kalibračních roztoků (roztoků standardů s postupně rostoucí koncentrací). Tyto roztoky jsou analyzovány pomocí kapalinové chromatografie. Na Obr. 4 je znázorněna grafická závislost plochy píku na koncentraci. Je vidět, že s rostoucí koncentrací lineárně roste odezva detektoru, tedy plocha píku. Tento graf není nutno konstruovat ručně nebo v excelu, lze využít ovládací software Chromeleon. Ten ze získané závislosti stanoví rovnici kalibrační křivky a pomocí ní pak přímo vypočítává koncentrace látek v roztoku. Pro každou analyzovanou látku je vlastní kalibrační přímka.

Pro kalibrační přímku platí vztah rovnice přímky, tedy:

Kde y je hodnota odezvy detektoru pro koncentraci , k je směrnice kalibrační přímky vyjadřující citlivost metody, q je úsek na ose y. Na základě rovnice kalibrační křivky se pomocí softwaru vypočítá koncentrace analytu v analyzovaném vzorku, tedy v nápoji nebo moči. Zároveň platí, že koncentrace analytu ve vzorku nesmí být nižší ani vyšší než je rozsah kalibrační řady.


O přírodovědě.cz

Centrum pro přírodovědné vzdělávání jsme založili primárně pro propagaci a podporu studia učitelství v deficitních aprobacích na PřF JU, pro podporu dalšího vzdělávání učitelů, pro spolupráci se SŠ a také mimoškolními vzdělávacími institucemi a jako popularizačně-edukační portál.